Baltymų išskyrimas ir gryninimas yra esminiai procesai biochemijos, biotechnologijos ir molekulinės biologijos srityse. Šie procesai leidžia atskirti ir koncentruoti specifinius baltymus iš sudėtingų biologinių mišinių, tokių kaip ląstelių lizatai ar audinių ekstraktai. Išgryninti baltymai naudojami įvairiems tikslams, įskaitant baltymų struktūros ir funkcijos tyrimus, vaistų kūrimą, diagnostinių testų kūrimą ir pramoninę fermentų gamybą.
Vienas iš plačiai naudojamų baltymų išskyrimo metodų yra išsodinimas amonio sulfatu. Šis metodas remiasi baltymų tirpumo skirtumais didelėse druskų koncentracijose. Amonio sulfatas ((NH₄)₂SO₄) yra labai tirpi druska, dažnai naudojama baltymams išskirti, nes ji nesukelia baltymų denatūracijos.
Išsodinimas amonio sulfatu, dar vadinamas išsūdymu, yra metodas, pagrįstas baltymų tirpumo mažėjimu didelėse druskų koncentracijose. Baltymų tirpumas priklauso nuo hidrofobinių ir hidrofilinių sąveikų tarp baltymo molekulės ir ją supančio tirpiklio (dažniausiai vandens).
Išsūdymas
Išsūdymas yra procesas, kurio metu didelės druskos koncentracijos pašalina vandens molekules, kurios paprastai supa baltymo molekulę. Druskos jonai konkuruoja su baltymų molekulėmis dėl sąveikos su vandeniu. Kai druskos koncentracija didėja, vandens molekulės labiau linkusios sąveikauti su druskos jonais nei su baltymu.
Dėl to hidrofobinės baltymo sritys tampa labiau veikiamos, o tai skatina baltymo molekulių agregaciją ir iškritimą iš tirpalo.
Taip pat skaitykite: Koncentracijos įtaka laidumui
Skirtingi baltymai išsiskiria iš tirpalo esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms. Šis skirtumas leidžia frakcionuotai išskirti baltymus, palaipsniui didinant amonio sulfato koncentraciją ir surenkant nuosėdas kiekviename etape. Baltymų, turinčių daugiau hidrofobinių paviršių, išsodinimui reikia mažesnės amonio sulfato koncentracijos, o baltymų, turinčių daugiau hidrofilinių paviršių, išsodinimui reikia didesnės koncentracijos.
Baltymo tirpumas taip pat priklauso nuo pH. Baltymo tirpumas yra mažiausias, kai pH yra lygus baltymo izoelektriniam taškui (pI). Izoelektrinis taškas yra pH reikšmė, kurioje baltymo molekulė neturi grynojo elektrinio krūvio.
Norint baltymą nusodinti, tikslinga daryti pH artimą pI.
Baltymų valymas
Amonio Sulfato Išsodinimo Procedūra
Amonio sulfato išsodinimo procedūra paprastai apima šiuos etapus:
Taip pat skaitykite: Garų priklausomybės analizė
- Mėginio paruošimas: Pradinis mėginys (pvz., ląstelių lizatas) paruošiamas pašalinant ląstelių nuolaužas ir kitas netirpias medžiagas centrifugavimu arba filtravimu.
- Amonio sulfato pridėjimas: Amonio sulfatas palaipsniui pridedamas prie mėginio, nuolat maišant, kad būtų užtikrintas tolygus pasiskirstymas. Pradedama nuo mažos koncentracijos, pvz., 20% prisotinimo, ir palaipsniui didinama iki norimos koncentracijos.
- Inkubavimas: Mėginys inkubuojamas tam tikrą laiką (pvz., 1-2 valandas) maišant, kad baltymai galėtų agreguotis ir iškristi.
- Centrifugavimas: Mėginys centrifuguojamas, kad nuosėdos būtų atskirtos nuo tirpalo. Nuosėdos, kuriose yra nusodinti baltymai, surenkamos.
- Resuspendavimas: Nuosėdos resuspenduojamos tinkamame buferiniame tirpale. Buferinis tirpalas parenkamas atsižvelgiant į tolesnius baltymų tyrimo etapus.
- Dializė arba desalinimas: Resuspenduotas baltymų tirpalas dializuojamas arba desalinuojamas, kad būtų pašalintas amonio sulfatas. Dializė atliekama naudojant membraną, kuri praleidžia mažas molekules, tokias kaip amonio sulfatas, bet sulaiko baltymus. Desalinimui gali būti naudojamos kolonėlės su sefadeksu.
Gryniems baltymams gauti reikia pašalinti druskų priemaišas. Tai atliekama dializuojant baltymų tirpalą. Sparčiau už dializę druskos pašalinamos, praleidžiant baltymų tirpalą pro kolonėlę su sefadeksu.
Svarbu: Denatūruojami baltymai netenka daugelio savybių, visų pirma biologinio aktyvumo. Baltymai denatūruojasi, net paprastoje temperatūroje koncentruojant jų tirpalus, todėl siekiant išvengti denatūracijos, baltymų tirpalai koncentruojami veikiant sefadeksu, kuris sugeria vandenį. Kietos formos baltymus patogiausia gauti liofilizacijos būdu.
Amonio Sulfato Išsodinimo Privalumai Ir Trūkumai
Privalumai:
- Ekonomiškumas: Amonio sulfatas yra pigi ir lengvai prieinama druska.
- Efektyvumas: Metodas efektyviai koncentruoja baltymus ir pašalina didelę dalį teršalų.
- Švelnus metodas: Amonio sulfatas retai denatūruoja baltymus, todėl išsaugomas jų biologinis aktyvumas.
- Universalumas: Metodas gali būti taikomas įvairiems baltymams išskirti.
Trūkumai:
- Mažas selektyvumas: Metodas nesuteikia didelio selektyvumo, todėl reikia papildomų gryninimo etapų.
- Druskos pašalinimas: Būtina pašalinti amonio sulfatą prieš tolesnius tyrimus, nes didelės druskos koncentracijos gali trukdyti kitiems metodams.
- Baltymų tirpumas: Kai kurie baltymai gali būti sunkiai ištirpinami po išsodinimo.
Kiti Baltymų Išskyrimo Metodai
Be amonio sulfato išsodinimo, yra ir kitų baltymų išskyrimo metodų, tokių kaip:
Taip pat skaitykite: Socialinio darbo metodai priklausomybėms įveikti
Afininė chromatografija
Šis metodas naudoja specifinį ligandą, kuris prisijungia prie norimo baltymo.
Jonų mainų chromatografija
Šis metodas atskiria baltymus pagal jų krūvį. Stacionarinė fazė susideda iš įkrautų dervų, kurios pritraukia priešingo krūvio baltymus. Baltymų eliucija atliekama keičiant druskos koncentraciją arba pH. Jonų mainų chromatografija yra labai efektyvus metodas baltymams išvalyti, pagrįstas jų krūvio savybėmis.
Dydžio atskyrimo chromatografija (gelio filtracija)
Šis metodas atskiria baltymus pagal jų molekulinę masę.
Hidrofobinė sąveikos chromatografija
Šis metodas atskiria baltymus pagal jų hidrofobiškumą.
Ultrafiltracija
Ultrafiltracija yra membraninės filtracijos tipas, naudojamas baltymams koncentruoti ir išvalyti. Šis metodas naudoja pusiau pralaidžią membraną, leidžiančią mažiems molekulėms praeiti, o stambios molekulės, tokios kaip baltymai, sulaikomos. Ultrafiltracija yra švelnus ir efektyvus būdas baltymams koncentruoti ir pašalinti teršalus, tokius kaip druskos ir maži baltymai.
Nusodinimas organiniais tirpikliais
Organiniai tirpikliai, tokie kaip etanolis arba acetonas, gali būti naudojami baltymams nusodinti. Šis metodas remiasi tuo, kad organiniai tirpikliai mažina vandens dielektrinę konstantą, todėl mažėja baltymų tirpumas.
Nusodinimas polimerais
Polimerai, tokie kaip polietilenglikolis (PEG), gali būti naudojami baltymams nusodinti. Šis metodas remiasi tuo, kad polimerai atitraukia vandenį nuo baltymų paviršiaus, todėl jie agreguojasi ir iškrenta iš tirpalo.
Lizocimo Išskyrimas Iš Vištos Kiaušinio Baltymo
Lizocimas yra fermentas, natūraliai randamas vištos kiaušinio baltyme, pasižymintis antibakterinėmis savybėmis. Lizocimo išskyrimui iš kiaušinio baltymo gali būti naudojamas amonio sulfato išsodinimas.
Pirmiausia kiaušinio baltymas atskiriamas nuo trynio ir praskiedžiamas buferiniu tirpalu. Tada palaipsniui pridedamas amonio sulfatas, nuolat maišant, kol pasiekiama norima koncentracija. Po inkubacijos mėginys centrifuguojamas, o nuosėdos, kuriose yra lizocimas, surenkamos. Nuosėdos resuspenduojamos buferiniame tirpale ir dializuojamos, kad būtų pašalintas amonio sulfatas. Išgrynintas lizocimas gali būti toliau analizuojamas ir naudojamas įvairiems tikslams.
Baltymų Kiekio Nustatymas
Po baltymų išskyrimo svarbu nustatyti baltymų koncentraciją. Yra įvairių metodų baltymų kiekiui nustatyti, įskaitant:
Bradford Metodas
Bradford metodas yra plačiai naudojamas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų gebėjimu prisijungti prie Coomassie Brilliant Blue G-250 dažų, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Metodas yra greitas, jautrus ir patogus, todėl tinka įvairiems baltymų mėginiams. Tačiau jis gali būti veikiamas trukdžių iš tam tikrų medžiagų, tokių kaip detergentai ir buferiai. Rinkoje yra įvairių spektrofotometrų, skirtų Bradford metodu pagrįstiems baltymų kiekybiniams tyrimams atlikti. Šie prietaisai skiriasi jautrumu, tikslumu ir automatizavimo lygiu.
Lowry Metodas
Lowry metodas yra kitas populiarus metodas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų reakcija su Folin-Ciocalteu reagentu, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Lowry metodas yra jautresnis nei Bradford metodas, tačiau jis yra labiau veikiamas trukdžių iš tam tikrų medžiagų.
Biuret Metodas
Biuret metodas yra senesnis metodas baltymų koncentracijai nustatyti. Jis remiasi baltymų reakcija su vario jonais šarminėje terpėje, sukeliant spalvos pokytį, kuris matuojamas spektrofotometriškai. Biuret metodas yra mažiau jautrus nei Bradford ir Lowry metodai, tačiau jis yra mažiau veikiamas trukdžių.
UV Absorbcijos Metodas
UV absorbcijos metodas remiasi baltymų gebėjimu absorbuoti ultravioletinę šviesą. Baltymų koncentracija gali būti nustatyta matuojant absorbciją prie 280 nm. Šis metodas yra greitas ir paprastas, tačiau jis yra mažiau jautrus nei kiti metodai.
Baltymų Grynumo Įvertinimas
Po baltymų išskyrimo ir koncentracijos nustatymo svarbu įvertinti baltymų grynumą.
SDS-PAGE Elektroforezė
SDS-PAGE (natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė) yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų molekulinę masę. SDS denatūruoja baltymus ir suteikia jiems neigiamą krūvį, todėl jie migruoja per gelį elektriniame lauke. SDS-PAGE yra galingas įrankis baltymų grynumui, molekulinei masei ir santykinei gausai įvertinti. Tai taip pat gali būti naudojama baltymų modifikacijoms, tokioms kaip glikozilinimas ir fosforilinimas, nustatyti.
Izoelektrinis Fokusavimas
Izoelektrinis fokusavimas yra metodas, naudojamas baltymams atskirti pagal jų izoelektrinį tašką (pI). Baltymų mišinys yra veikiamas pH gradiento, todėl baltymai migruoja tol, kol pasiekia savo pI, kur jie sustoja.
Chromatografija
Chromatografijos metodai, tokie kaip jonų mainų chromatografija ir dydžio atskyrimo chromatografija, gali būti naudojami baltymų grynumui įvertinti.
Rinkoje Parduodami Aparatai Ir Jų Palyginimas
Bradford Metodas
Rinkoje yra įvairių spektrofotometrų, skirtų Bradford metodu pagrįstiems baltymų kiekybiniams tyrimams atlikti. Šie prietaisai skiriasi jautrumu, tikslumu ir automatizavimo lygiu. Kai kurie spektrofotometrai skirti darbui su dideliu pralaidumu, o kiti yra optimizuoti darbui su mažos apimties mėginiais. Prieš pasirenkant spektrofotometrą, būtina atsižvelgti į konkrečius tyrimo reikalavimus.
SDS-PAGE Analizė
SDS-PAGE analizė atliekama naudojant elektroforezės įrangą, kurią sudaro maitinimo šaltinis, elektroforezės kamera ir geliai. Rinkoje yra įvairių dydžių ir konfigūracijų elektroforezės kamerų, skirtų skirtingiems mėginių pralaidumams. Maitinimo šaltiniai turėtų būti pajėgūs tiekti pastovią įtampą ir srovę, kad būtų užtikrintas patikimas ir atkuriamas atskyrimas.
Jonų Mainų Chromatografija
Jonų mainų chromatografijai naudojamos chromatografijos kolonos, užpildytos jonų mainų dervomis. Rinkoje yra įvairių tipų dervų, skirtų skirtingiems baltymams atskirti. Chromatografijos sistemos gali būti automatizuotos, kad būtų galima optimizuoti atskyrimo procesą. Automatizuotos sistemos paprastai apima siurblį, purkštuvą, kolonų krosnį ir detektorių.
Ultrafiltracija
Ultrafiltracijos įranga apima membranas ir filtracijos sistemas. Membranos skiriasi pagal porų dydį ir medžiagą, o filtracijos sistemos gali būti partinės arba nuolatinės. Partinės sistemos tinka nedideliems mėginių kiekiams, o nuolatinės sistemos tinka dideliems mėginių kiekiams.
Centrifugavimas
Centrifugavimas yra naudojamas ląstelėms ir kitiems kietiems elementams atskirti nuo skysčių. Centrifugos skiriasi pagal greitį ir talpą. Didelio greičio centrifugos naudojamos baltymams ir kitiems smulkiems daleliams nusodinti, o mažo greičio centrifugos naudojamos ląstelėms ir nuolaužoms nusodinti.
Metodų Alternatyvos
Alternatyvos Kiaušinio Baltymo Atskyrimui
Be tradicinių metodų, tokių kaip amonio sulfato nusodinimas ir dializė, galima naudoti ir kitus baltymų atskyrimo metodus, įskaitant afininę chromatografiją ir dviejų fazių atskyrimą vandeniniais polimerais. Afininė chromatografija yra labai selektyvus metodas, kuris naudoja specifinį prisijungimo ligandą baltymams atskirti pagal jų afinitetą. Dviejų fazių atskyrimas vandeniniais polimerais naudoja dviejų nesimaišančių polimerų, tokių kaip polietilenglikolis ir dekstranas, sistemą baltymams atskirti pagal jų hidrofobines savybes.
Alternatyvos Jonų Mainų Chromatografijai
Alternatyvūs metodai jonų mainų chromatografijai apima hidrofobinę sąveikos chromatografiją ir dydžio atskyrimo chromatografiją. Hidrofobinė sąveikos chromatografija atskiria baltymus pagal jų hidrofobiškumą, o dydžio atskyrimo chromatografija atskiria baltymus pagal jų molekulinę masę. Hidrofobinė sąveikos chromatografija ypač tinka baltymams, kurie neturi stipraus krūvio, atskirti, o dydžio atskyrimo chromatografija tinka baltymams atskirti pagal jų molekulinę masę.
Šiame straipsnyje apžvelgiami įvairūs metodai, naudojami lizocimui išgryninti iš vištos kiaušinio baltymo, taip pat aptariami rinkoje esantys prietaisai, alternatyvūs metodai ir jų palyginimas.
tags: #amonio #sulfato #koncentracijos #priklausomybe #baltymo