Baltymų nusodinimas - tai procesas, kurio metu baltymai atskiriami nuo tirpalo, dažniausiai naudojant tam tikrus reagentus, kad sumažėtų jų tirpumas. Šis metodas yra plačiai taikomas biochemijoje ir molekulinėje biologijoje, siekiant koncentruoti baltymus, juos išgryninti arba pašalinti trukdančius komponentus iš mėginio. Vienas iš dažniausiai naudojamų reagentų baltymų nusodinimui yra amonio sulfatas.
Amonio sulfatas ir jo vaidmuo baltymų nusodinime
Amonio sulfatas ((NH4)2SO4) yra labai tirpi druska, dažnai naudojama baltymams išskirti, nes ji nesukelia baltymų denatūracijos. Išsodinimas amonio sulfatu, dar vadinamas išsūdymu, yra metodas, pagrįstas baltymų tirpumo mažėjimu didelėse druskų koncentracijose. Amonio sulfatas padidina tirpalo jonų stiprumą, sumažina atstumiamąją jėgą tarp baltymų molekulių, skatina baltymų molekulių agregaciją ir nusodinimą.
Veikimo principas ir priklausomybė nuo įsotinimo laipsnio
Didelės amonio sulfato koncentracijos atveju, druskos jonai konkuruoja su baltymų molekulėmis dėl vandens molekulių. Druskų jonams atėmus hidratuotą vandenį, baltymų molekulės sukimba į didesnius agregatus, kurie ir iškrenta nuosėdomis. Toks procesas vadinamas išsūdymu. Skirtingi baltymai išsiskiria iš tirpalo esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms. Šis skirtumas leidžia frakcionuotai išskirti baltymus, palaipsniui didinant amonio sulfato koncentraciją ir surenkant nuosėdas kiekviename etape.
Baltymų, turinčių daugiau hidrofobinių paviršių, išsodinimui reikia mažesnės amonio sulfato koncentracijos, o baltymų, turinčių daugiau hidrofilinių paviršių, išsodinimui reikia didesnės koncentracijos. Baltymo tirpumas taip pat priklauso nuo pH. Baltymo tirpumas yra mažiausias, kai pH yra lygus baltymo izoelektriniam taškui (pI).
Praktinė procedūra: mėginio paruošimas ir nusodinimo etapai
Mėginio paruošimas: Pradinis mėginys (pvz., ląstelių lizatas) paruošiamas pašalinant ląstelių nuolaužas ir kitas netirpias medžiagas centrifugavimu arba filtravimu. Pirma, būtina suskaidyti ląsteles ir išlaisvinti tarpląstelinius baltymus fiziniais ar cheminiais metodais.
Taip pat skaitykite: baltymų tirpumo priklausomybė nuo amonio sulfato koncentracijos
- Amonio sulfato pridėjimas: Amonio sulfatas palaipsniui pridedamas prie mėginio, nuolat maišant, kad būtų užtikrintas tolygus pasiskirstymas. Pradedama nuo mažos koncentracijos, pvz., 20% prisotinimo, ir palaipsniui didinama iki norimos koncentracijos.
- Inkubavimas: Mėginys inkubuojamas tam tikrą laiką (pvz., 1-2 valandas) maišant, kad baltymai galėtų agreguotis ir iškristi.
- Centrifugavimas: Mėginys centrifuguojamas, kad nuosėdos būtų atskirtos nuo tirpalo. Nuosėdos, kuriose yra nusodinti baltymai, surenkamos.
- Resuspendavimas: Nuosėdos resuspenduojamos tinkamame buferiniame tirpale. Buferinis tirpalas parenkamas atsižvelgiant į tolesnius baltymų tyrimo etapus.
- Dializė arba desalinimas: Resuspenduotas baltymų tirpalas dializuojamas arba desalinuojamas, kad būtų pašalintas amonio sulfatas. Dializė atliekama naudojant membraną, kuri praleidžia mažas molekules, tokias kaip amonio sulfatas, bet sulaiko baltymus. Desalinimui gali būti naudojamos kolonėlės su sefadeksu.
Frakcionavimo pavyzdžiai
Amonio sulfato nusodinimas gali būti naudojamas frakcionuotam baltymų atskyrimui. Pavyzdžiui, globulinai iškrinta esant mažesnei amonio sulfato koncentracijai nei albuminai.
Pavyzdys: Į mėgintuvėlį įpilama ir gerai sumaišoma 5 ml baltymų ir 5 ml sotaus amonio sulfato tirpalo. Iškrinta globulinai, kurie po 5 min. nufiltruojami. Į filtratą pridedama gerai susmulkinto amonio sulfato tiek, kad tirpalas būtų sotus. Iškrinta albuminų nuosėdos.
Privalumai ir trūkumai
| Privalumai | Trūkumai |
|---|---|
| Efektyvus ir plačiai taikomas baltymų nusodinimo metodas. | Mažas selektyvumas: metodas nesuteikia didelio selektyvumo, todėl reikia papildomų gryninimo etapų. |
| Amonio sulfatas yra labai tirpus vandenyje, todėl galima pasiekti dideles druskos koncentracijas. | Druskos pašalinimas: būtina pašalinti amonio sulfatą prieš tolesnius tyrimus, nes didelės druskos koncentracijos gali trukdyti kitiems metodams. |
| Santykinai nebrangus ir lengvai prieinamas. | Amonio sulfato nuosėdose gali likti druskos priemaišų, kurias reikia pašalinti dializuojant arba naudojant sefadeksą. |
| Dažniausiai nedentūruoja baltymų, todėl jie gali būti vėl ištirpinti ir naudojami. | Gali nusodinti ir nepageidaujamus baltymus, mažinant metodų selektyvumą. |
Druskos įsotinimo laipsnio reikšmė ir skaičiavimai
Praktikoje amonio sulfato koncentracijos nurodomos procentais prisotinimo (saturacijos) laipsniu. Priklausomai nuo temperatūros ir tirpiklio tūrio, tam tikras amonio sulfato masės kiekis atitinka tam tikrą prisotinimo procentą. Palaipsniui didinant prisotinimo laipsnį, iš tirpalo nusodinami skirtingi baltymų kompleksai. Taip formuojamas frakcionavimo schema, kurioje surenkamos nuosėdos kiekviename prisotinimo intervale.
Druskos pašalinimas ir baltymų atstatymas
Gryniems baltymams gauti reikia pašalinti druskų priemaišas. Tai atliekama dializuojant baltymų tirpalą. Sparčiau už dializę druskos pašalinamos, praleidžiant baltymų tirpalą pro kolonėlę su sefadeksu. Svarbu: denatūruojami baltymai netenka daugelio savybių, visų pirma biologinio aktyvumo. Baltymai denatūruojasi, net paprastoje temperatūroje koncentruojant jų tirpalus, todėl siekiant išvengti denatūracijos, baltymų tirpalai koncentruojami veikiant sefadeksu, kuris sugeria vandenį. Kietos formos baltymus patogiausia gauti liofilizacijos būdu.
Baltymų charakterizacija po nusodinimo
Po baltymų išskyrimo ir koncentracijos nustatymo svarbu įvertinti baltymų grynumą ir identifikuoti frakcijas. Dažniausiai naudojami metodai:
Taip pat skaitykite: Socialinio darbo metodai priklausomybėms įveikti
- Bradford metodas - greitas, jautrus ir patogus baltymų kiekybiniams tyrimams, pagrįstas baltymų gebėjimu prisijungti prie Coomassie Brilliant Blue G-250; tačiau gali būti veikiamas trukdžių iš detergentų ir buferių.
- SDS-PAGE - natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezė, naudojama baltymams atskirti pagal molekulinę masę; SDS denatūruoja baltymus ir suteikia jiems neigiamą krūvį.
- Izoelektrinis fokusavimas - atskiria baltymus pagal jų izoelektrinį tašką (pI) naudojant pH gradiento migraciją.
- Jonų mainų chromatografija, gelio filtracija, afinė chromatografija - tolesni gryninimo ir analizės žingsniai.
Alternatyvos ir derinimo galimybės
Be amonio sulfato nusodinimo, yra ir kitų metodų, naudojamų baltymams atskirti ir išgryninti: dializė, gelfiltracija, ultracentrifugavimas, ultrafiltracija, afininė chromatografija, jonų mainų chromatografija, hidrofobinė sąveikos chromatografija, dydžio atskyrimo chromatografija, dviejų fazių atskyrimas vandeniniais polimerais. Dažnai amonio sulfato frakcionavimas naudojamas kaip pradinis žingsnis, po kurio taikomi selektyvesni chromatografiniai metodai.
Praktiniai pavyzdžiai ir taikymas
Lizocimo išskyrimas iš vištos kiaušinio baltymo: pirmiausia kiaušinio baltymas atskiriamas nuo trynio ir praskiedžiamas buferiniu tirpalu. Tada palaipsniui pridedamas amonio sulfatas, nuolat maišant, kol pasiekiama norima koncentracija. Po inkubacijos mėginys centrifuguojamas, o nuosėdos, kuriose yra lizocimas, surenkamos. Nuosėdos resuspenduojamos buferiniame tirpale ir dializuojamos, kad būtų pašalintas amonio sulfatas.
Amonio sulfatas yra labai plačiai naudojamas tiek laboratorijose, tiek pramonėje dėl savo ekonomiškumo, kūrimo paprastumo ir santykinio švelnumo baltymams. Dėl šių savybių jis yra tinkamas didelio masto preparatyviniam naudojimui, tačiau dažnai reikalingi papildomi gryninimo žingsniai, jei reikalingas aukštas grynumas.
Համա-Հ.Մ.Ը.Մ.ական 13-րդ Բանակումի Բացման Հանդիսութիւն
Tendencijos ir tobulinimo kryptys
Gilėjant baltymų tyrimams, nuolat didėja ir reikalavimai baltymų gryninimo technologijai. Didelės skiriamosios gebos chromatografijos technologija, automatizavimas ir miniatiūrizavimas, žalioji chemija - pagrindinės kryptys, kurios leis tobulinti amonio sulfato panaudojimą derinant jį su šiuolaikinėmis technologijomis. Amonio sulfatas, kaip tradicinis baltymų nusodintuvas, išlieka nepakeičiamas pradinis žingsnis daugelio baltymų valymo schemų kontekste.
Baltymų atskyrimas ir gryninimas yra esminiai žingsniai biotechnologijų srityje, o amonio sulfatas, kaip dažniausiai naudojamas baltymų nusodintuvas, vaidina svarbų vaidmenį baltymų gryninimo procese. Skirtingų baltymų tirpumo skirtumai esant skirtingoms amonio sulfato koncentracijoms leidžia selektyviai nusodinti tikslinius baltymus, palaipsniui didinant amonio sulfato koncentraciją.
Taip pat skaitykite: Kaip atpažinti priklausomybę nuo muzikos
tags: #baltymu #misinio #issodinimo #priklausomybe #nuo #amonio